FULL-LENGTH cDNA CLONING AND STRUCTURAL DIFFERENCES OF THE CAST GENE FROM CTENOPHARYNGODON IDELLUS (♀), SQUALIOBARBUS CURRICULUS (♂) AND THEIR HYBRID F1
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摘要: 钙蛋白酶抑制蛋白(Calpastatin, CAST)在肌肉生长和肉质特征形成中发挥重要作用。为探究草鱼(Ctenopharyngodon idellus) (♀)×赤眼鳟(Squaliobarbus curriculus) (♂)正交F1的肉质相关分子基础, 通过RACE(Rapid-amplification of cDNA ends) 技术分别克隆了草鱼(♀)×赤眼鳟(♂) F1及其亲本的CAST基因cDNA全长, 并利用生物信息学方法分析比较了三种鱼的CAST结构差异。结果表明: 草鱼(♀)、赤眼鳟(♂)及草鱼(♀)×赤眼鳟(♂) F1的CAST基因cDNA全长分别为3036、3165和3086 bp, 编码901、893和904个氨基酸; 预测蛋白质分子量分别为93.72、92.77和94.02 kD; 推测的理论等电点分别为5.92、6.01和6.02。草鱼(♀)×赤眼鳟(♂) F1 CAST与草鱼(♀)和赤眼鳟(♂)核苷酸序列相似性分别为94.52%和90%。三种CAST蛋白均包括4个含有典型七肽的钙蛋白酶抑制结构域。草鱼(♀)、赤眼鳟(♂)和F1 CAST氨基酸残基中分别存在73、82和75个潜在的磷酸化修饰位点。蛋白三级结构分析显示草鱼(♀)、赤眼鳟(♂)和F1 CAST中分别含有24、12和20个β-折叠, 且均呈链状结构。综合可知, F1 CAST在序列相似度、磷酸化位点数、蛋白质结构及进化地位与草鱼(♀)均更接近。该研究结果为阐明草鱼(♀)×赤眼鳟(♂)正交F1肉质形成机理提供了分子基础。Abstract: Calpastatin plays an important role in muscle growth and meat quality formation. To investigate the molecular basis of the meat quality of hybrid F1 from Ctenopharyngodon idellus (♀) × Squaliobarbus curriculus (♂), the full-length cDNAs of CiCAST, ScCAST and their hybrid F1 CAST were cloned by using RACE technology, and structure differences were analyzed by bioinformatics tools in this study. The results showed that the full-length cDNA of CiCAST, ScCAST and hybrid F1 CAST were 3036, 3165 and 3086 bp in length and encoded 901, 893 and 904 amino acids, respectively; the predicted molecular weights were 93.72, 92.77 and 94.02 kDa, and the theoretical isoelectric points were 5.92, 6.01 and 6.02, respectively. The nucleotide sequence similarity of CAST between F1 CAST and CiCAST was 94.52% and was 90% between F1 CAST and ScCAST. The three CAST proteins contained four typical calpain inhibitory domains, which had typical heptapeptide structures. A prediction of the phosphorylation sites showed that there were 73, 82 and 75 potential phosphorylation modification sites in the amino acid residues of CiCAST, ScCAST and F1CAST, respectively. The CAST tertiary structure analysis showed that CiCAST, ScCAST and F1CAST contained 24, 12 and 20 β-folds, which were all formed into β-chain structures. It was concluded that F1 CAST was more similar to CiCAST in sequence similarity, number of phosphorylation sites, protein structure and evolutionary status. The results provide a molecular basis for the elucidation of meat quality formation in hybrid F1 fish.
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Keywords:
- Ctenopharyngodon idellus /
- Squaliobarbus curriculus /
- Hybrid F1 /
- CAST /
- Structural differences
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鱼类杂交一般指不同品种、品系、种、属、亚科等亲缘关系较远的个体之间的交配[1], 其后代可获得杂种优势, 在鱼类育种工作中具有很大的利用价值[2—5]。远缘杂交因亲本遗传差异明显大于近缘杂交, 其杂交子代性状具有更大的可塑性, 杂种优势往往表现更为明显[6]。杂交子代在染色体和DNA水平上可以产生广泛的变异, 是杂种优势产生的基础[7]。赤眼鳟俗称“野草鱼”, 与草鱼同属雅罗鱼亚科, 具有较强的抗病能力[8]。已有研究表明, 正交F1(草鱼♀×赤眼鳟♂)能正常存活, 且表现出优于草鱼的疾病抗性及肌肉品质[9]。
鱼类的肉质品质是评价其营养价值的重要指标[10, 11]。李迪等[12]比较分析了草鱼(♀)、赤眼鳟(♂)及正交F1的肉质基本特性, 发现正交F1肌肉比父、母本弹性大、嫩度高, 肉质更坚韧。李伟等[13]测定了草鱼、赤眼鳟及正交F1背部肌肉的营养成分, 发现正交F1表现出肌肉弹性大、嫩度高和蛋白质丰富等杂种优势。但正交F1肉质特征的分子特性及遗传基础尚不明确。
蛋白酶系统参与肌原纤维降解过程, 通过钙离子调控肌原纤维蛋白的性质和比例而影响肉的硬度[14]。作为蛋白酶系统中的重要功能分子和影响肉质嫩度的重要候选基因, 钙蛋白酶抑制蛋白(Calpastatin, CAST)可以特异性识别并抑制钙蛋白酶(Calpain, CAPN)的表达及自溶稳定性[15]; 最终降低CAPN降解蛋白的速度, 有助于肌肉生长[16]。目前已在鲤(Cyprinus carpio)[17]中克隆和鉴定了CAST基因。该研究克隆了草鱼(♀)、赤眼鳟(♂)及其正交F1 CAST基因的cDNA全长, 分析并比较三种鱼该基因和蛋白结构上的差异, 以期为正交F1肉质的分子及遗传特征研究提供基础。
1. 材料与方法
1.1 实验材料
该研究所用的健康草鱼、赤眼鳟及正交F1(草鱼♀×赤眼鳟♂)均购于浏阳市北盛镇乌龙渔场, 所有试验鱼均为2018年5月繁育的个体, 平均体重(14.50±1.25) g, 购回后放于恒温水循环养殖系统28℃暂养1个月, 每箱放养草鱼、赤眼鳟及正交F1各10尾, 每日按其体重的3%早、晚各投喂一次饲料。
1.2 RNA提取及cDNA合成
从养殖系统中选取健康草鱼、赤眼鳟及正交F1各1尾, 分别取肌肉组织80 mg, 按总RNA提取试剂盒(Omega, 美国)说明提取总RNA, 用核酸蛋白仪检测总RNA的质量和浓度, 并用1%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性。取2 µg质量和完整性好的RNA (A260/A280值在1.8—2.2), 按第一链 cDNA合成试剂盒(Fermentas, 美国) 的说明合成cDNA模板, 用于全长cDNA序列中间片段的克隆。参照SMARTer RACE 5′/3′ cDNA试剂盒 (Clontech, 美国) 说明书分别合成5′-RACE和3′-RACE cDNA模板, 用于5′/3′ cDNA末端克隆。
1.3 CAST基因全长cDNA克隆
基于本课题组前期草鱼转录组测序所得CAST基因部分序列(共1779 bp)以及GenBank中草鱼CAST基因片段(登录号: JF825477.1), 用Oligo7.0软件设计草鱼CAST基因3′ 和5′ 端的特异性扩增引物(表 1), 分别以合成的草鱼5′和3′-RACE cDNA为模板扩增对应的末端序列。PCR反应条件为94℃预变性5min; 94℃ 30s, 58℃ 30s, 72℃ 60s, 共30个循环; 72℃延伸7min。将得到的目的片段PCR产物切胶回收, 克隆至pMD19-T载体, 挑取阳性克隆送武汉奥科鼎盛生物科技有限公司测序。赤眼鳟及正交F1 CAST cDNA全长序列获取参考已得到的草鱼CAST cDNA序列, 使用Oligo7.0软件设计引物; 分别以赤眼鳟第一链cDNA及正交F1 第一链cDNA作为模板扩增中间序列; 赤眼鳟CAST与正交F1 CAST 5′/3′ cDNA末端序列的获取同草鱼。
表 1 本文所用的引物序列Table 1. Primer sequences used in this study引物名称
Primer name引物序列
Sequence (5′－3′)用途
UsageScCAST-F TTCGTTCAGCAGGCATGTCC 扩增中间序列 ScCAST-R CAATCTATCTGTTTCCGCCCTT 扩增中间序列 F1CAST-F GGCACTTTACCATCATCACAACC 扩增中间序列 F1CAST-R CAATCTATCTGTTTCCGCCCTT 扩增中间序列 CiCAST5′-RACE GCCTTAACATCAGGTGCTGCCACG RACE PCR CiCAST3′-RACE CCCACTGTCCCATCTGCTGCCACGACC RACE PCR ScCAST5′-RACE ACCGTGAAGCCCTCCGCACCTGA RACE PCR ScCAST3′-RACE AGATGCCTGCCGAACGAACATCGACT RACE PCR F1CAST5′-RACE CCGCCCCTGTCCCGCCTAAAGCCAT RACE PCR F1CAST3′-RACE CTCTCTCCCCGACAAGAACACCC RACE PCR 注: Ci. 草鱼; Sc. 赤眼鳟; F1. 草鱼(♀)×赤眼鳟(♂) F1Note: Ci. Ctenopharyngodon idellus; Sc. Squaliobarbus curriculus; F1. progeny of Ctenopharyngodon idellus (♀) × Squaliobarbus curriculus (♂) 1.4 CAST生物信息学分析
使用DNAStar软件拼接获得cDNA序列, 利用SMART (https://smart.embl-heidelberg.de)、SignalP 4.1 Server和ProtParamhttps://web.expasy.org/protparam在线软件分析氨基酸理化性质、信号肽和蛋白质结构域等, 通过NetPhos 3.1 Server在线软件预测蛋白磷酸化位点。使用BLAST在线比对分析序列的相似性, 通过DNAMAN对CAST蛋白进行多序列比对; 应用MEGA 6.0软件中的邻接法构建CAST的系统发育树(分支可信度设为1000次自展检测); 使用I-TASSER (https://zhanglab.ccmb.med.umich.edu) 和PYMOL软件对蛋白质三级结构进行分析。
2. 结果
2.1 CAST cDNA全长序列分析
草鱼(♀)、赤眼鳟(♂)及其正交F1的CAST cDNA全长序列已提交至GenBank, 获得序列登录号分别为KT780366.1、KU994884和KU994883。草鱼(♀)、赤眼鳟(♂)和正交F1 CAST cDNA序列全长分别为3036、3165和3086 bp; 其5′端非编码区依次为104、118和136 bp, 开放阅读框分别为 2706、2682和2715 bp, 3′端非编码区依次为226、365和235 bp; 分别编码901、893和904个氨基酸。利用Blast软件比对结果显示正交F1与母本草鱼(♀) CAST cDNA全长序列的同源性为94.52%, 高于其与父本赤眼鳟(♂)的同源性(90%)。
2.2 CAST蛋白功能结构域分析
草鱼(♀)、赤眼鳟(♂)和正交F1 CAST的推导蛋白质分子质量分别为93.72、92.77和94.02 kD, 理论等电点依次为5.92、6.01和6.02。NetPhos3.1 Server预测草鱼(♀)、赤眼鳟(♂)及正交F1 CAST蛋白氨基酸残基中潜在丝氨酸(Ser)、苏氨酸 (Thr) 和酪氨酸 (Tyr) 磷酸化修饰位点。结果表明, 草鱼(♀)、赤眼鳟(♂)和正交F1 CAST氨基酸残基中分别潜在73个 (Ser: 49, Thr: 23, Tyr:1)、82个 (Ser: 54, Thr: 26, Tyr: 2)和75个 (Ser: 51, Thr: 23, Tyr: 1) 磷酸化修饰位点。SMART软件分析结果显示, 草鱼(♀)、赤眼鳟(♂) 及正交F1均包含4个钙蛋白酶抑制结构域, 正交F1与草鱼对应结构域的结构域排布更为相似(图 1)。
使用I-TASSER和PYMOL软件预测了草鱼(♀)、赤眼鳟(♂)和正交F1的CAST蛋白三级结构。预测的蛋白均由主要β-折叠和无规则卷曲结构组成, 草鱼(♀)、赤眼鳟(♂)和正交F1 CAST分别拥有24、12和20个β-折叠, 在蛋白三级结构上正交F1与草鱼更为相近(图 2)。
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图 2 CAST三级结构预测A、B、C和D分别表示草鱼(♀)、赤眼鳟(♂)、正交F1和三种结果同一界面组合的三级结构预测图Figure 2. 3D structure prediction of CASTThe 3D structure prediction results of CiCAST, ScCAST, F1 CAST and a combination of three 3D structures are represented by A, B, C and D, respectively2.3 CAST钙蛋白酶抑制结构域差异比对
以草鱼(♀)、赤眼鳟(♂)和正交F1为核心对象, 选择金线鲃 (Sinocyclocheilus grahami)、鲤 (Cyprinus carpio)、斑马鱼 (Danio rerio)、爪蟾 (Xenopus laevis)、牛 (Bos taurus)及眼镜王蛇 (Ophiophagus hannah)作为参照, 通过DNAMAN软件对此9个物种CAST的4个钙蛋白酶抑制结构域进行多序。
鱼类CAST蛋白的4个钙蛋白酶抑制结构域中都包含一个保守的“Thr-IIe-Pro-Pro-X-Try-Arg”七肽序列(X代表任意氨基酸)。鱼类的七肽序列具有高度保守性, 哺乳类、两栖类和爬行类与鱼类七肽序列存在部分差异。草鱼(♀)、赤眼鳟(♂)和正交F1的4个钙蛋白酶抑制结构域序列中均包含高度保守的七肽序列, 其中正交F1与草鱼对应的4个七肽序列完全一致, 而与赤眼鳟第1和第4个钙蛋白酶抑制结构域序列中的七肽序列一致; 赤眼鳟第2和第3个钙蛋白酶抑制结构域序列中的七肽序列与草鱼和正交F1对应序列均存在1个氨基酸残基差异位点。
2.4 系统进化关系分析
对草鱼(♀)、赤眼鳟(♂)、正交F1与不同分类地位物种的CAST进化关系进行分析(图 3), 整个系统发育树可分为两个大支: 硬骨鱼类聚为一支, 鸟类、爬行类、两栖类和哺乳类聚为另一支。在硬骨鱼类中, 淡水鱼 (如鲤、斑马鱼等)和海水硬骨鱼类(如巴丁鱼Pangasianodon hypophthalmus、虹鳟Oncorhynchus mykiss等)进化距离相对较远; 正交F1和母本草鱼(♀)进化关系较其与父本赤眼鳟(♂)更近。
3. 讨论
为了更深入地了解草鱼(♀)×赤眼鳟(♂)远缘杂交后代的肉质形成相关分子基础, 研究克隆获得了草鱼(♀)、赤眼鳟(♂)及正交F1 三种鱼的CAST cDNA全长序列, 并以此为基础进行了三种鱼CAST序列相似性、蛋白组成及修饰、功能结构域特征以及系统进化关系的比较。就CAST而言, 各种不同层面的结构分析结果均提示正交F1与母本草鱼(♀)遗传信息更为接近。据此推测正交F1与母本草鱼(♀) CAST蛋白结合Ca2+调节钙蛋白酶活性的功能可能更相近[18]。
蛋白质磷酸化是由蛋白质激酶催化的磷酸基团转移反应, 是常见且重要的蛋白质翻译后修饰方式之一 [19], 亦是生物调节控制蛋白质活力和功能的有效途径[20]。真核生物中主要在丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸等氨基酸残基位点发生磷酸化修饰[21]。该研究通过预测草鱼(♀)、赤眼鳟(♂)及正交F1磷酸化修饰位点, 获知草鱼CAST蛋白共有73个磷酸化位点, 赤眼鳟共有82个磷酸化位点, 而正交F1具有75个潜在磷酸化位点。正交F1与草鱼(♀)的磷酸化位点相比仅相差2个丝氨酸磷酸化位点, 而与赤眼鳟存在1—3个数量不等的丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸位点差异。磷酸化修饰位点数量多少可以直接影响到蛋白质活性[22, 23], 因而三种鱼CAST蛋白的调节活性及功能可能存在差异。据此推测正交F1 CAST蛋白活性与母本草鱼更相似, 是偏向于受母本遗传信息影响的杂交种。
草鱼(♀)、赤眼鳟(♂)及正交F1 CAST蛋白均具有4个典型的钙蛋白酶抑制结构域, 与鲤[17]等其他鱼类中CAST蛋白研究结果相一致。CAST 4个钙蛋白酶抑制结构域的任一结构域均能抑制一种CAPN蛋白活性, 完整的 CAST 蛋白能够同时抑制4个CAPN 蛋白分子[24]。对不同物种钙蛋白酶抑制结构域的氨基酸残基序列分析发现, 鱼类CAST蛋白的4个钙蛋白酶抑制结构域均各包含一个保守的“Thr-IIe-Pro-Pro-X-Try-Arg”七肽序列。该序列可能是CAST蛋白起抑制作用的关键部位, 鱼类同哺乳类等该区域的差异可能导致CAST蛋白抑制CAPN的作用效果不同[25－27]。该研究发现正交F1与母本草鱼(♀)七肽位点序列完全一致, 而与父本赤眼鳟(♂)存在部分位点的差异, 预示正交F1 CAST抑制CAPN的功能与草鱼更接近, 而同赤眼鳟可能存在差异[28]。此外, 相对于哺乳动物而言, 鱼类CAST蛋白缺少了L结构域; 虽然此结构域的功能尚未明确, 但可能是鱼类和哺乳类之间CAST序列同源性及功能差异形成的主要影响区域[29]。本研究团队通过质构仪对正交F1及其亲本的肉质进行了测定, 研究结果显示正交F1综合了双亲的优异肉质特性, 呈现出弹性大, 嫩度高, 肉质坚韧等品质; 亦分析过CAST在草鱼、赤眼鳟及其正交F1肌肉中的表达量, 结果显示正交F1 CAST基因表达量与赤眼鳟无显著差异, 而显著高于其母本草鱼[12]。CAST基因表达量差异对肉质的影响有待深入研究。
4. 结论
该研究首次获得了草鱼(♀)、赤眼鳟(♂)及正交F1 CAST的cDNA全长序列, 发现正交F1 CAST在序列同源性、蛋白组成和修饰、功能结构域特征以及系统进化关系等方面与母本草鱼(♀)更为接近; 表明正交F1 CAST功能可能与母本草鱼(♀)更相似。所得数据为进一步解析钙蛋白酶系统在鱼肉品质形成过程中的作用提供了分子基础。
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图 2 CAST三级结构预测
A、B、C和D分别表示草鱼(♀)、赤眼鳟(♂)、正交F1和三种结果同一界面组合的三级结构预测图
Figure 2. 3D structure prediction of CAST
The 3D structure prediction results of CiCAST, ScCAST, F1 CAST and a combination of three 3D structures are represented by A, B, C and D, respectively
表 1 本文所用的引物序列
Table 1 Primer sequences used in this study
引物名称
Primer name引物序列
Sequence (5′－3′)用途
UsageScCAST-F TTCGTTCAGCAGGCATGTCC 扩增中间序列 ScCAST-R CAATCTATCTGTTTCCGCCCTT 扩增中间序列 F1CAST-F GGCACTTTACCATCATCACAACC 扩增中间序列 F1CAST-R CAATCTATCTGTTTCCGCCCTT 扩增中间序列 CiCAST5′-RACE GCCTTAACATCAGGTGCTGCCACG RACE PCR CiCAST3′-RACE CCCACTGTCCCATCTGCTGCCACGACC RACE PCR ScCAST5′-RACE ACCGTGAAGCCCTCCGCACCTGA RACE PCR ScCAST3′-RACE AGATGCCTGCCGAACGAACATCGACT RACE PCR F1CAST5′-RACE CCGCCCCTGTCCCGCCTAAAGCCAT RACE PCR F1CAST3′-RACE CTCTCTCCCCGACAAGAACACCC RACE PCR 注: Ci. 草鱼; Sc. 赤眼鳟; F1. 草鱼(♀)×赤眼鳟(♂) F1Note: Ci. Ctenopharyngodon idellus; Sc. Squaliobarbus curriculus; F1. progeny of Ctenopharyngodon idellus (♀) × Squaliobarbus curriculus (♂) 
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